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一、實驗前準備

1、清理實驗臺及儀器

2、開啟冷凍切片機并將冷凍切片機預降至所需溫度（- 15~-20 ℃*）

3、準備好處理好的載玻片、刀片、膠水以及藥品

二、取材

解剖之后迅速取出所需的新鮮組織，用干紗布或濾紙擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形狀不一的空泡,使細胞內結構移位。

注：取材中目的標本既要明確也要確保其結構的完整性，應避免不必要的脂肪及壞死組織附著;要盡量剔除毛發、硬骨或鈣化物;保乳手術切緣由于脂肪組織較多,取材厚度好不要超過 3mm，厚者冰凍費時，大者難以切完整。甲狀腺及淋巴結組織要帶全組織被膜并除去多余的脂肪組織。

三、冷凍切片

1、取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上冰凍，細胞系用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結成白色冰體即可切片（1~3分種）。

2、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。

3、調好欲切的厚度，根據不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5 ～10μm間。

4、調好防卷板。制作冰凍切片，關鍵在于防卷板的調節上，這就要求操作者要細心，準確地將其調較好，調校至適當的位置。切片時，以切出完整、平滑的切片為準。切好的組織在干凈的玻片上黏附時順著一個方向稍微用力輕輕一帶 ,可避免組織攤片過程中皺折 ,保證組織結構的完整及切片的美觀。

注：①包埋劑的選用：包埋劑是對冷凍切片質量一重要影響因素，包埋劑用量要適宜，過多或過少都會影響標本冷凍質量。常用的有三種包埋劑OCT劑、B超藕合劑以及普通膠水。B超藕合劑適用于細胞豐富質地較嫩的組織,普通膠水或 OCT劑適用于纖維豐富質地偏硬組織。（OCT包埋劑驟冷時固化，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近，其還具有水溶性，不影響染色等優點。）

②組織塊過小：先將少量膠擠在托架上預先放在冰凍機中冷凍,約30秒鐘左右待膠凝固時將小組織放上,組織周圍再加一些膠,再次置于冷凍機中冷凍,這樣組織被墊高,就能快速切出高質量的切片。

③冷凍箱及冷凍頭的溫度高低，要根據不同的組織而定。溫度過低會導致組織塊過硬,切片碎裂,出現梯田狀薄厚不均或空洞;反之,溫度過高,組織塊硬度不夠 ,切片不易成形或成皺褶。數據圖1供參考。

④當切片時，如果發現冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調高冰凍點。

⑤用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發生上述的現象。

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